【基础知识】光学显微镜的重要技术参数

在镜检过程中,追求清晰而明亮的理想图像是每个使用者的目标。这要求显微镜的各项光学技术参数必须达到精确的标准,并且在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况,精准地调整各参数间的关系。唯有如此,才能充分发挥显微镜的性能,从而得到满意的镜检效果。

显微镜的光学技术参数纷繁复杂,包括数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场直径、覆盖差以及工作距离等。这些参数并非越高越好,而是相互关联、相互制约的。在实际使用中,需要根据镜检的具体需求,灵活调整这些参数。

一、数值孔径
数值孔径,简写为NA,是物镜和聚光镜的关键技术参数。它不仅是衡量两者性能高低的重要标志,特别是物镜消除位置色差的能力,还能体现像差校正的能力。数值孔径的大小通常刻在物镜和聚光镜的外壳上,是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。孔径角,也被称为“镜口角”,是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所夹的角度。增大孔径角可以提高进入物镜的光通量,而孔径角与物镜的有效直径成正比,与焦距成反比。

为了增大NA值,由于孔径角无法进一步增大,我们通常选择增大介质的折射率。基于此原理,水浸系物镜和油浸物镜应运而生,因介质的折射率n值大于1,使得NA值能够大于1。数值孔径的最大理论和技术极限为1.4。然而,通过采用折射率更高的介质,如溴萘(折射率为1.66),我们可以使得NA值超过1.4。此外,为了充分发挥物镜的数值孔径,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。数值孔径与其他技术参数密切相关,它几乎决定了其他各项技术参数的表现。例如,数值孔径与分辨率和放大率成正比,而与焦深成反比。随着NA值的增大,视场直径与工作距离会相应减小。

二、分辨率
分辨率,也被称为“鉴别率”或“解像力”,是衡量显微镜性能的又一关键指标。显微镜的分辨率可以用公式d=0.61λ/NA来表示,其中d为最小分辨距离,λ为光线的波长,NA为物镜的数值孔径。由此可见,物镜的分辨率由物镜的NA值和照明光源的波长共同决定。当NA值增大或照明光线波长缩短时,d值会减小,从而提高分辨率。

要提高分辨率,我们可以采取以下措施:首先,降低波长λ值,即使用短波长光源;其次,增大介质n值和提高NA值;再次,消除色差;最后,增加明暗反差。

三、放大率
放大率,即放大倍数,是指被检验物体经过物镜和目镜的连续放大后,人眼所观察到的最终图像大小与原物体大小的比值。它是物镜和目镜放大倍数的乘积。尽管放大率是显微镜的重要参数,但并非越高越好。在选择时,我们应首先考虑物镜的数值孔径和其他相关参数。

四、焦深
焦深,即焦点深度的简称,是指在显微镜使用过程中,当焦点对准某一物体时,不仅该点平面上的各点可以清晰看见,而且在此平面上下一定厚度内的区域也能保持清晰。这个清晰区域的厚度就是焦深。焦深的大小直接影响到我们能观察到的被检物体的层次范围。焦深与其他技术参数有以下关系:首先,焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比;其次,焦深增大时,分辨率会降低。由于低倍物镜的景深较大,因此在低倍物镜下的显微照相可能会遇到一些困难。

五、视场直径
视场直径,也被称为视场宽度,是指在显微镜下观察到的圆形视场内所能容纳的被检物体的实际范围。它是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径的大小适中最为科学,因为过大的视场直径可能会导致场曲。视场直径与视场数成正比,而增大物镜的倍数会导致视场直径减小。因此,在低倍镜下我们可以看到被检物体的全貌,但切换到高倍物镜后,就只能看到被检物体的一小部分。

六、覆盖差
显微镜的光学系统还包括盖玻片。由于盖玻片的厚度可能不标准,光线从盖玻片进入空气时会产生折射,导致光路改变,从而产生像差,这就是覆盖差。覆盖差会影响显微镜的成像质量。为了解决这个问题,国际上规定了盖玻片的标准厚度为0.17mm,允许的范围在0.16—0.18mm之间。在物镜的制造过程中,已经考虑了这一厚度范围内的像差。因此,我们在使用物镜时,应确保使用符合标准厚度的盖玻片。

七、工作距离

工作距离,也被称为物距,是指物镜前透镜的表面至被检物体之间的垂直距离。在进行镜检时,被检物体应当位于物镜的一倍至二倍焦距的区间内。因此,工作距离与焦距是两个不同的概念,尽管在日常使用中,我们习惯将调焦与工作距离联系在一起,实际上,调焦更多的是在调节这一工作距离。

值得注意的是,在物镜的数值孔径保持一定的条件下,工作距离与孔径角之间存在着密切的关系。具体来说,当工作距离较短时,孔径角会相应增大。而高倍物镜,由于其数值孔径较大,往往伴随着较小的工作距离。这一特性在显微镜的使用中尤为重要,需要我们在实际操作时加以注意和调节,以确保获得最佳的观测效果。

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